基迪奧合作客戶文章 |小RNA揭示血管平滑肌細胞損傷修復機制

更新日期:2019-03-13
基迪奧生物

 

實驗方法


血管平滑肌細胞(VSMC)空白組,與血小板共培養的處理組,每組三個重復進行miRNA測序。

 

研究思路


作者通過發現與預期不符的結果,提出miRNA可能在其中起的作用,對miRNA及其靶基因進行驗證,最終發現了VSMC損傷修復的模型。


研究思路

 

研究結果


1.發現問題——血小板誘導VSMC分化


在最開始的實驗中,作者將活化血小板(APs)和人主動脈血管平滑肌細胞VSMC共培養,預期的結果是血小板會誘導VSMC去分化。但是結果卻出乎意料,經APs共培養的VSMC的分化標志物的蛋白表達明顯高于靜止血小板共培養(RPs)和無血小板共培養(Ctrl),同時VSMC去分化標志物同時顯著降低(圖1),表明活化的血小板反而誘導了VSMC的分化。


這個結果與眾所周知的血小板活化會促進VSMC去分化這一觀念相反。那么在這個結果背后應該有其他的分子參與進來,作者首先想到了miRNA,血小板中的miRNA是比較理想的分子,因為它們可以催化調節許多蛋白質,確保VSMC回到分化的靜止狀態。因此開展了后續的研究。PS:miRNA還會調控靶基因導致抑制蛋白翻譯,如果我們做實驗發現mRNA和蛋白的結果相反時,也可以考慮下是否有miRNA在其中起作用哦~


圖1. VSMC的分化和去分化標志物的表達情況


2.找到原因——活化的血小板將mirna轉移到VSMC中以抑制VSMC的去分化

作者通過體內和體外實驗,發現在動脈損傷時活化的血小板被轉移到VSMC的內部。內化的血小板必須包含有效的藥物來啟動從VSMC去分化到分化的轉換,而血小板中有大量的miRNA。作者通過與活化血小板共培養的VSMCs的透射電鏡成像,證明了miRNA從內化的活化血小板轉移到VSMCs中。


為了尋找參與VSMC去分化過程中起作用的血小板miRNA,作者對與血小板共培養(APs)或空白組 (control)的VSMC進行miRNA測序。通過miRNA測序找到許多差異表達的miRNA,在其中找到關鍵miRNA:miR-223,miR-143/145。


為了進一步驗證miRNA在其中的作用,作者使用前列環素(防止血小板活化)或RNase A(降解RNA)預處理血小板,結果發現會顯著降低VSMCs中miR-223和miR-143/145的表達(圖2C),而前列環素和RNase A的預處理會顯著降低APs對VSMCs的促分化作用(圖2D)。


這些結果顯示VSMCs通過吸收活化血小板,使血小板miRNA水平轉移到VSMCs,從而使VSMC去分化的狀態轉化為VSMC分化。



3.尋找miRNA的靶基因


由于miRNA通過靶向mRNA起作用,因此作者通過生信分析和熒光素酶報告基因檢測,發現了miR-143、miR-145和miR-223的靶基因KLF4、KLF5和PDGFRβ。


為了進一步證明血小板miR-143、miR-145和miR-223確實對VSMC表型轉換至關重要,作者進行了挽救實驗。


在正常葡萄糖水平和高糖條件下研究miR-143、miR-145和miR-223和其靶基因KLF4、KLF5和PDGFRβ的表達量變化情況。作者發現在共培養早期(6-12小時),血小板釋放的PDGF促進VSMC增殖, miR-223在VSMCs中積累。隨后(24 - 48小時), VSMCs利用miR-223抑制細胞增殖及靶基因PDGFRβ的表達 (圖3)。


綜上所述,這些數據表明血小板釋放的miRNA是VSMC轉化的主要調控因子。

圖3.細胞增殖率、miR-223和PDGFRβ的表達情況

4.驗證靶向關系

雖然上一步通過表達量的關系,作者推測出了miR-223和PDGFRβ的關系,但是還需要進一步進行驗證。因此作者在受傷和未受傷的股動脈中進行了miR-223抑制試驗。在未受傷的血管中,PDGFRβ的表達很低。在損傷后4周,相比于對照組,miR-223 被抑制的實驗組中PDGFRβ的表達上調(圖4)。這些結果表明, PDGFRβ的確是miR-223的靶基因。


miR-143、miR-145同時存在于血小板和VSMC中,而miR-223特異性表達于造血系統(包括血小板)中,在VSMC沒有顯著表達。因此作者還進行了一項實驗,證明在VSMCs共培養中內化的活化血小板的miR-223水平明顯高于活化血小板衍生微粒。結合之前發現的內化血小板的大小和形態,這些研究表明了miR-223是從激活的全血小板轉移到VSMC中,并促使了VSMC的表型轉換。


圖4. 受傷股動脈的VSMCs 中PDGFRβ的表達情況

 

5.在糖尿病患者中推測理論


在糖尿病等病理條件下,血小板中的miRNA水平會發生改變,而作者研究觀察到患糖尿病(DM)的人和小鼠的血小板中miR-223的表達降低(圖5),因此作者對DM和WT小鼠進行研究,通過熒光原位雜交發現,在DM條件下,盡管血小板被內化到VSMCs中,但血小板中的mirna水平轉移明顯減少,并且導致它們的靶基因在體內的表達增加。


這些結果與之前的體外研究結果一致,即血小板來源的miR-223水平轉移到VSMC,通過下調PDGFRβ從而抑制VSMC的去分化。但DM的條件下, miR-223 的表達降低,PDGFRβ的表達增加,導致血管平滑肌細胞增殖和內膜的增生。


圖5.miR-223在健康受試者和DM患者、非DM小鼠和DM小鼠血小板中的表達


6.模型——提出了正常和DM血小板中mirna轉移到受損血管VSMCs的模型


通過上述一系列的研究,作者提出了VSMC損傷修復機制的模型:在正常生理過程中,內皮屏障是完整的,血小板是靜止的,與VSMC沒有相互作用。當受到損傷時,內皮屏障受損,暴露內皮下層,導致血小板活化。


除了血栓形成外,還釋放出可啟動傷口修復的藥物,包括誘導VSMC脫分化和細胞增殖。激活的血小板隨后被VSMC吸收,并釋放miR-223以及其他如miR143/145,這些miRNA對VSMC脫分化起抑制作用,轉而向VSMC分化。后續延遲反應會阻止VSMC的過度修復,從而減少內膜增生。但在miR-223減少的DM血小板中,VSMC會發生過度增殖導致內膜的過度增生。


圖.VSMC損傷修復模型

小結


作者首先從前期實驗發現了與預期相反的結果中提出了假設:可能存在miRNA在其中起作用,隨后找出可能起作用的miR-223,并對其驗證;接著尋找miR-223的靶基因PDGFRβ,并驗證了靶向關系,從而推測出VSMC損傷修復的模型。


除了在正常水平下,作者還想到了糖尿病的情況下miRNA的表達會降低,從而推測出糖尿病情況下VSMC的損傷修復模型。在一步步的抽絲剝繭中將VSMC損傷修復的機制完整的展現出來,是一個非常值得借鑒的文章思路哦。

Tips:

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